毛雪慧1, 2,徐明芳3,刘 辉1,肖 娜1 （1·暨南大学水生生物研究所，广东广州 510632; 2·深圳市水务规划设计院，广东深圳 518036; 3·暨南大学生物工程系，广东广州 510632） 摘要：比较了4种固定化球形红假单胞菌（Rhodopseudomonas sphaeroides）处理含Cd、Cr重金属废水的效果，对固定化菌吸附Cd和Cr的工艺条件进行了优化，并通过生物反应器连续处理实际电镀废水，分析了处理后的效果。通过比较，确定了20 g·kg-1沸石和20 g·L-1海藻酸钠组合作为共固定材料，固定化菌对Cd和Cr的去除效果明显优于游离菌。采用正交试验优化废水处理工艺条件，结果表明，废水pH值、菌体投加量对固定化菌体的处理效果影响较大，当处理废水的pH值为6·0、菌体投加量为10·00 g·L-1时，对40·00 mg·L-1含Cd废水的去除率可达96·68%。4轮吸附-解吸循环试验结果显示，固定化菌体可重复利用3次，固定化菌体在使用第3次时， Cd去除率仍可达51·20%。在生物反应器中，用固定化菌体处理质量浓度为92·61 mg·L-1的含Cd电镀废水， 3 h时对Cd的去除率达到98·80%,对含Cu、Au、Ni废水中重金属的去除率也高于90·00%。 关键词：固定化；球形红假单胞菌；重金属废水；生物反应器 中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1673-4831（2010）02-0160-07 随着我国工业的发展，含有铅、镉、汞及铬等有害重金属的工业废水排放量日益增加，含有这些重金属的废水一旦排入江河湖海，将使水体受到污染，严重地危害工农业与渔业生产[1-2]。工业电镀废水大致来自电镀漂洗、前处理废水、后处理废水以及电镀废液等，这些废水主要含镉、铬、镍等重金属离子，它们一旦进入环境后，不能被生物降解，大多数参与食物链循环，并在生物体内积累，破坏生物体的正常生理代谢活动，危害人体健康[3]。因此，工业电镀废水必须进行治理，达到清除或减少其对环境污染的要求。 光合细菌紫色非硫菌群的红假单胞菌属对重金属具有极强的耐受能力[4-6]。但废水中要去除的重金属离子大多是有毒、有害的，若浓度较高，会抑制生物的活性，甚至使其中毒死亡。若菌体与载体固定化，则可明显提高其沉降性能，保持包埋菌占优势，菌体抗毒性能和耐受力明显增加，且易固液分离[7]。海藻酸钠[（C5H7O4COONa）n, CA]是海带、巨藻中的有机高分子电解物，含有游离羧基（—COONa），能够与重金属离子发生反应[8]。以往的研究中， CA作为包埋剂应用时存在着机械强度差、在水中易被细菌分解等缺点，为了克服其缺点，笔者分别采用不同种类的凝胶剂（聚乙烯醇、明胶、沸石）与CA溶液混合制成包埋剂溶液。为探索生物固定化技术在工业电镀废水处理中的应用，笔者选取球形红假单胞菌（Rhodopseudomonas sphae-roides）作为研究对象，利用沸石和海藻酸钠作为固定化载体，研究了固定化菌体对含镉、铬电镀废水重金属的吸附性能，并利用固定化菌体的生物反应器工艺处理废水，为今后生物固定化技术在重金属废水处理中的实际应用提供科学依据。 1 材料与方法 1·1 试验材料 1·1·1 试验菌种 球形红假单胞菌（Rhodopseudomonas sphae-roides）由暨南大学生物工程实验室分离纯化得到。将球形红假单胞菌按照体积分数为10·00%的接种量接种到液体富集培养液[9]中，于30℃、[光]照度4 000 lx下培养2 d,然后以5 000 r·min-1离心15min,弃去上清液，收集菌泥，用9·0 g·L-1生理盐水冲洗3次，再用蒸馏水稀释菌泥，使浓缩菌液最终D660为2·00,即菌体含量（以干重计）最终为1·65g·L-1, 4℃下保存备用。 1·1·2 试验废水 模拟废水：主要含Cd和Cr 2种金属，称取（0·203 2±0·000 1） g氯化镉（CdCl2·2·5H2O）和（0·282 9±0·000 1）g重铬酸钾（K2Cr2O7）于2个烧杯中，加适量去离子水溶解后分别移入1 L容量瓶中，并用去离子水定容至刻度，得到100·00 mg·L-1Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）储备液。试验时移取不同体积的储备液稀释至一定体积，得到不同浓度的模拟废水。实际废水：采于深圳市淼英辉实业有限公司电镀后的废水，经过滤后存放在1 L玻璃瓶中， pH值为5·3,置于4℃下保存备用。 1·2 固定化方法 1·2·1 包埋法[10-11] 称取聚乙烯醇（PVA）2·40 g（或明胶0·36 g或沸石0·48 g），CA 0·48 g,溶于20 mL水，加热溶解，灭菌后加入菌体搅匀，用10 mL无菌注射器从10cm高处滴入20 g·L-1CaCl2饱和硼酸溶液（交联剂）中，交联成直径约为3 mm的球体，放入冰箱中继续固定化12 h。收获的颗粒测得湿重后用无菌水洗涤，保存在8·5 g·L-1生理盐水中。 1·2·2 吸附法 将聚丙烯酸系高吸水性多孔树脂颗粒（灭菌）加入1 mL浓缩菌液中，以1 mL无菌水作对照， 24 h后，将吸附后变大的树脂小球，保存在烧杯中备用。 1·3 试验方法 1·3·1 吸附试验 在50mL具塞三角瓶中放入由4种固定化载体固定的球形红假单胞菌颗粒，颗粒投加量5·00 g（相当于浓缩菌液1 mL），加入初始质量浓度为3·69mg·L-1含重金属Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）的废水，在30℃、150 r·min-1下处理20 h后，取样测定重金属离子浓度，计算吸附量和去除率。试验设游离态球形红假单胞菌和固定化球形红假单胞菌2种处理，比较不同固定化载体种类、包埋比等对重金属去除效果的影响。投加等量的固定化未加菌颗粒吸附重金属，以此作为对照试验。试验设3个平行。 1·3·2 工艺条件的正交试验设计 为研究各种条件下固定化球形红假单胞菌吸附重金属的综合效应，本试验选取固定化菌颗粒投加量（A）、吸附时间（B）、pH值（C）作为影响吸附的3个主要因素，分别设3个水平（表1）。
于100 mL具塞三角瓶中放入包埋剂为20 g·kg-1沸石和20 g·L-1CA的固定化球形红假单胞菌颗粒，加入一定体积和浓度的重金属离子废水，然后放入振荡器中，在一定温度、一定转速条件下振荡一定时间，测定重金属离子浓度，计算去除率。 1·3·3 固定化菌体的可重复利用性[12] 将固定化菌体投加到质量浓度为40·00 mg·L-1含Cd废水中。将装有固定化菌体的烧瓶置于25℃、150 r·min-1的恒温振荡器中吸附重金属，吸附结束后，从振荡器中取出并用去离子水洗涤2次，弃上清液，分别加入10 mL不同浓度的HNO3, 25℃下振荡解吸60 min,用去离子水清洗2次，然后再次吸附，如此重复操作。 1·3·4 生物反应器模型试验 采用生物反应器连续处理电镀废水（图1）。反应柱长20 cm,直径4 cm,下端进水流速为1·00mL·min-1,上端出水。向反应柱中投加10·00 g固定化球形红假单胞菌颗粒，颗粒包埋剂为20 g·kg-1沸石和20 g·L-1CA,包埋比（浓缩菌液与包埋剂溶液的体积比）为1∶5,粒径3 mm。设置曝气量为0·80 L·min-1, 25℃下反应3 h,用等离子体电感耦合（ICP-AES）发射光谱仪测定吸附后残留上清液中重金属含量，计算重金属去除率。
1·4 分析方法 1·4·1 重金属含量测定[13] 采用ICP-AES法。 1·4·2 重金属吸附量的计算 q=（Co-Ce）×V/W（1） 式（1）中，q—重金属离子吸附量（以菌体质量计），mg·g-1;Co—吸附前溶液中重金属离子含量，mg·L-1;Ce—吸附后溶液中重金属离子含量，mg·L-1;V—溶液体积，L;W—细胞质量， g。 1·4·3 重金属去除率的测定方法 取水样20 mL,以3 000 r·min-1速度离心10min,取上清液10 mL,测定重金属离子含量，计算去除率。 去除率=（C1-C2） /C1×100% （2） 式（2）中，C1—水样中起始重金属含量，mg·L-1;C2—已处理水样中重金属含量，mg·L-1。 1·4·4 固定化颗粒的结构表征 采用PHILIPSXL-30 ESEM型扫描电镜（荷兰飞利浦）观察固定化颗粒表面结构。首先用25·0mL·L-1戊二醛固定液将颗粒固定1 h,再用酒精逐级增加浓度以对颗粒进行脱水，然后用临界点干燥器干燥颗粒，再在真空下喷金，最后在扫描电镜下进行观察、拍照。 2 结果与讨论 2·1 固定化球形红假单胞菌对重金属的去除作用 2·1·1 固定化载体种类对重金属去除效果的影响包埋法固定菌体是指将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中。凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄漏，同时能让重金属渗入。合适的载体不仅要能将菌体固定于其中，而且不损害细菌活性，有良好的通透性，使重金属离子容易透过载体空隙渗入到载体内而被细菌吸附。经不同载体固定后的球形红假单胞菌颗粒对Cr、Cd的吸附效率见图2。
由图2可知， 20 h后， 4种不同固定材料的固定化菌对Cd、Cr的吸附效果明显，沸石和明胶作为包埋剂的颗粒吸附量大于PVA, Cd吸附量最高达95·54 mg·g-1, Cr吸附量最高达63·57 mg·g-1。游离球形红假单胞菌对Cd、Cr的吸附量分别为39·70、27·55 mg·g-1,这是因为光合细菌细胞壁化学功能团（氨基、羟基、磷酸基等）与所吸附的重金属离子形成离子键或共价键[5, 14]。游离态的光合细菌对重金属离子的吸附过程分为2个阶段[15]:第1阶段是金属离子在细胞表面的吸附，即细胞外多聚物、细胞壁上的官能基团与金属离子结合的被动吸附；第2阶段是活体细胞的主动吸附，即细胞表面吸附的金属离子与细胞表面的某些酶相结合而转移至细胞内，它包括传输和沉积，其中活的和死的光合细菌细胞的吸附机理不尽相同[16]。 由图3B可见，海藻酸钠与沸石包埋的颗粒表面凹凸不平，沸石镶嵌或包埋在颗粒表面和内部。沸石是一种具有硅氧（SiO4）四面体和铝氧（AlO4）四面体骨架的含水铝硅酸盐矿物，这种铝氧四面体对外呈现负电性，因而会在铝氧四面体附近携带一个带正电荷的金属阳离子[17]。因此，沸石具有一定的离子交换性能。而包埋后的颗粒具有包埋和吸附的双重功能，因此其对Cd、Cr的吸附效率比以明胶作为包埋剂的颗粒高。与明胶颗粒相比，沸石晶体结构具有大量的孔穴通道，孔穴中阳离子的存在使其具有静电吸引力[18],能达到包埋和吸附的双重效果，而且使颗粒的通透性和渗透性得到改善，增强了颗粒中所包埋的球形红假单胞菌与外界水环境的物质传递能力，从而使球形红假单胞菌大量繁殖，因此，以沸石为包埋剂的固定化菌颗粒的活性比明胶高。
如图3C所示，海藻酸钠与明胶包埋的颗粒表面较为光滑，说明海藻酸钠与明胶具有良好相容性，这种密实的结构导致颗粒的传质性能差[19],明胶能通过酰胺键与多种物质发生氢键作用而产生沉淀[20],因此明胶颗粒对Cd、Cr的吸附量比沸石颗粒略低。 如图3D所示，海藻酸钠与PVA包埋的颗粒表面呈网格交联状，在颗粒内部存在许多孔隙，孔隙内部分布着细菌。PVA与海藻酸钠交联后，分子链中的氢键被削弱，且2者形成的网状结构互相贯穿，交联的紧密性减少[21],这种结构有利于细菌在颗粒内部生长繁殖。但包埋后有效的吸附位点减少，同时由于PVA-硼酸交联形成的凝胶可能妨碍Cd、C与菌体上吸附位点充分接触[22]。因此，PVA颗粒对Cd、Cr的吸附量比沸石颗粒低。 由图3E所示，高吸水树脂球形红假单胞菌颗粒表面凹凸不平，光合细菌吸附在颗粒的内部和表面。高吸水树脂分子链上带有—COOH、—OH、—SO3H及酰胺基等功能基团中的一种或几种，这些基团对金属离子具有良好的吸附性能[23]。高吸水树脂吸附菌液后可能达到饱和状态，限制了对重金属的吸附作用。 2·1·2 固定化载体的包埋比对重金属去除效果的影响 包埋比对重金属离子去除效果的影响如图4所示。当包埋比为1∶2时，固定化菌体对Cd和Cr去除率最低，分别为86·87%、9·69%,当包埋比为1∶5时，对Cd和Cr去除率增至88·95%、18·67%。
2·2 各种影响因素对工艺处理效果的影响 2·2·1 处理时间对去除率的影响 取废水水样50 mL,分别加入固定化光合细菌5·00 g,颗粒包埋比1∶5,粒径3 mm, 30℃下不同振荡吸附时间对Cr和Cd去除率的影响见图5。由图5可知，随着吸附时间延长，吸附量逐渐升高，Cr和Cd去除率逐渐增大，固定化光合细菌对Cr和Cd的吸附作用在较短时间内就能达到平衡，当吸附时间达30min后，去除率变化不大，吸附基本达到饱和。为保证离子吸附完全，选择振荡吸附时间为60min。
2·2·2 pH值对去除率的影响 取试验水样5份，用盐酸和NaOH溶液调节pH值至3·0、4·0、5·0、6·0、7·0,分别加入固定化球形红假单胞菌5·00 g, 30℃下振荡吸附60 min。不同pH条件下固定化菌对Cr和Cd吸附效果见图6。 图6显示， pH值对固定化球形红假单胞菌吸附Cr和Cd均有较大影响。pH值较低时，由于H+与Cd存在竞争吸附，故影响吸附效果，吸附量较低。随着pH值的升高，对Cd吸附量升高，去除率增加。当pH值为6·0~7·0时，Cd吸附量达到最大，此后，随着pH值的升高，对Cd去除率略降。固定化菌对Cd吸附的最佳pH值为6·0 ~7·0。当pH值为1·0~2·0时，对Cr吸附量达到最大，此后，随着pH值的升高，去除率下降，固定化菌对Cr吸附的最佳pH值为1·0~2·0。这可能是由于光合细菌属于革兰阴性菌，其等电点在pH值为4·0~5·0,当体系pH
2·2·3 固定化菌体投加量对去除率的影响
取试验水样5份，每份50 mL,分别加入1·00、5·00、10·00、20·00、30·00 g固定化球形红假单胞菌颗粒， pH值6·0、30℃下振荡吸附60 min后，测定吸附液中Cr和Cd含量，结果见图7。图7显示，随着固定化菌体投加量的增加，去除率也逐渐增加。因为菌体量增加，比表面积增大，可供吸附Cr和Cd的表面位点增加。固定化菌对Cr和Cd吸附的最佳投加量范围为10·00~20·00 g·L-1。
2·2·4 废水处理工艺条件的正交试验设计
为了考察各因素对固定化球形红假单胞菌吸附Cd的影响，设计了1组正交试验（表2）。由表2可知，在9个处理中，最优处理组合为2号处理，即A1B2C2（根据某因子所对应最大均值所在水平而定），Cd去除率为96·68%。在正交试验中，影响Cd去除率的3个因素主次顺序是： C>A>B,极差RC明显大于RA和RB,可知pH值对固定化球形红假单胞菌吸附Cd的影响效应最大。最优组合为A1B2C2,即固定化菌颗粒投加量为10·00 g·L-1、吸附时间为60 min、pH值为6·0时吸附效果达最佳。由表3可知，固定化菌颗粒投加量的F=0·186,P=0·843>0·05,吸附时间的F=0·116,P=0·896>0·05, pH值的F=156·719,P=0·006<0·05,表明固定化菌颗粒投加量和吸附时间对Cd去除率的影响不显着，而pH值对Cd去除率的影响显着。
2·3 固定化菌体的可重复利用性
固定化菌体的可重复利用性对固定化技术能否工业化应用有着重要影响。固定化菌体重复使用3次后，其吸附效果依然较好。固定化菌体在第3次使用时，对Cd去除率为51·20%,经过第4次吸附，处理效果仍可达35·42%,且优于游离菌（31·46% ）。固定化菌体多次使用后其吸附率下降的原因可能是HNO3破坏球形红假单胞菌的细胞结构。
2·4 生物反应器对实际重金属废水的处理效果
从某电镀厂采集电镀废水，装在塑料瓶中，静置1 d,过滤除去不溶性杂质后取10 mL,用ICP-AES发射光谱仪测定污水中Cd、Cu、Cr、Au、Ni 5种重金属含量。将固定化菌投加到重金属废水中。25℃、振速150 r·min-1、曝气量4·02 L·min-1下曝气处理3 h,用ICP-AES发射光谱仪测定吸附后上清液中残留重金属含量，确定重金属去除率。生物反应器对电镀废水的实际处理效果见表4。
由表4可见，用固定化菌体生物反应器处理电镀废水效果较好。对Cd、Cr去除率分别达到98·80%、20·70%,对12·90 mg·L-1含Cu废水的去除率也达到95·30%。这说明固定化菌体生物反应器适合处理电镀废水。对于实际工业化应用，则需进一步的研究，并根据废水流量等实际情况来确定采取间歇或者连续运行模式。
3·结论
（1）通过比较4种固定化球形红假单胞菌对含Cd、Cr废水的处理效果，确定了20 g·kg-1沸石和20 g·L-1海藻酸钠组合作为共固定材料，固定化菌对Cd和Cr的去除效果明显优于游离菌，且固定化菌对Cd的去除效果优于Cr。
（2）比较不同包埋比的固定化球形红假单胞菌处理含Cd和Cr废水的效果可知，固定化菌对Cd的处理效果（88·95% ）明显优于Cr（18·67% ）。
（3）利用沸石和海藻酸钠包埋法共固定球形红假单胞菌，对固定化菌吸附Cd的工艺条件进行了优化。结果表明，固定化菌对重金属有良好的富集性能，投加10·00 g·L-1固定化菌体，对40·00mg·L-1Cd的去除率可达96·68%。废水pH值、菌体投加量对固定化菌体去除Cd的能力影响较大，其最佳值分别为pH 6·0、投加量10·00 g·L-1。
（4）4轮吸附-解吸循环试验结果显示固定化菌体可重复利用3次，固定化菌体在使用第3次时，对40·00 mg·L-1含Cd废水的去除率为51·20%。
（5）在生物反应器中，用固定化菌体处理实际含92·61 mg·L-1Cd的电镀废水， 3 h时Cd去除率达到98·80%;对含Cu、Au、Ni废水中重金属去除率也高于90·00%,表明该工艺具有较好的工业化前景。
（6）从固定化球形红假单胞菌处理重金属废水的研究与应用来看，固定化球形红假单胞菌处理系统主要优势在于吸收、转化重金属离子，但目前还缺乏针对固定化菌去除Hg、Ni等其他重金属离子的处理系统设计参数的研究，因此，全面研究固定化球形红假单胞菌去除各种重金属离子的处理系统设计参数应是下一步工作的重点。
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