2．1菌种来源
自然环境中，能够降解石油成分的微生物多达200种以上。其中，假单胞菌属、棒杆菌属、微球菌属和产碱杆菌属中存在许多高效降解石油成分的细菌菌株[2-3]。本试验从各种石油污染的环境中采集菌种样品，作为富集驯化的菌源：(1)以威海槐云路五菱汽车修配厂废机油、汽油、柴油污染的土壤为样品1；(2)以威海东方大众汽配厂受油污污染的土壤为样品2；(3)以威海宇成线业有限公司污水排放口的土壤为样品3；(4)以电镀厂废油污染的土壤为样品4。
2．2培养基
牛肉膏蛋白胨培养基用于细菌总数的测定和微生物分离，原油无机盐培养基用于原油降解菌平板数量的测定。原油无机盐培养基(pH=7．2)的成分如下(以质量分数表示)：润滑油0．2‰NaCl 0．5‰(NH4)2S040．1％，MgS04·7H20 0．025％，NaN030．2％，KH2P040．5％，K2HP04·H20 1．0％，琼脂l．6％。
2．3试剂和仪器
所用石油醚等试剂均为市售分析纯。
恒温振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；pH／温度测试笔，意大利哈钠公司；紫外一可见分光光度计、分析天平和可见分光光度计，上海精密仪器有限公司；离心机，上海安亭科学仪器厂。
2．4富集驯化处理
各称取1～4号样品200 g，分别加入蒸馏水800 mL，搅拌30 min，静置沉淀，上清液转移到l0 L的玻璃瓶中，从而获得多种来源的混合菌种。然后，加入土壤浸提液1L[1 L水中加入200 g肥沃土壤(提供各种元素)，搅拌，沉淀，获得的上清液为土壤浸提液]，控制温度在35 ℃、pH 8．5，曝气富集驯化数天。混合液曝气驯化l d后测定残油含量，然后定量补充润滑油、无机磷和无机氮等元素，调整混合液中碳、氮、磷的比例，以利于微生物的生长。富集驯化液中C(即7样机油，为驯化液质量分数的l％)、N[即(NH4)2S04]和P(即KH2P04)的质量比约为l00：5：1。除油微生物驯化装置如图l所示。
 图1除油微生物富集驯化装置 Figure l Device for enrichment and domestication of microbes
2．5测定指标
石油含量的测定采用紫外分光光度法，混合液中油的提取方法如下：将定量的待测样品移入250 mL分液漏斗中，加入质量分数50％的硫酸5 mL酸化，按混合液质量的2％加入氯化钠，用20 mL石油醚清洗采样器皿，移入分液漏斗，萃取，油层移入100 mL容量瓶中。萃取完全后，用石油醚稀释至标线。在选定波长处，用10 min石英比色皿、以石油醚为空白试样测量吸光度，根据标准曲线计算出石油的含量。
2．6驯化过程中微生物的变化
驯化的初期和末期，分别利用牛肉膏蛋白胨培养基和原油培养基、采用MPN(Maximum Probable Number)法测定异养细菌和原油降解菌的数目，在30 ℃下，分别培养l周和2周[2]，然后统计细菌的数目。利用牛肉膏蛋白胨固体培养基分别对驯化前、后的微生物进行分离，在30 ℃下培养3 d，观察平板分离的菌株，将菌落形态和菌体形态一致的菌落作为纯种予以保留。
2．7正交试验因素水平
在驯化的末期，以驯化液和分离的菌种混合液制作的混合菌液进行正交试验[5]，按L9(34)考察接种量、初始pH、温度和加油量对降解率的影响。正交试验因素水平见表1。在300 mL的三角瓶中，按正交表设定装入混合菌液，不足的部分以无机盐培养基补足，液体总体积为100 mL。在30 ℃、150 r／min的摇床中培养24 h后，利用紫外分光光度法测定残油的含量。
表1正交试验因素水平表
Table1 Factors and levels of orthogonal test
 2．8金属表面除油效果试验
以硫酸铜浸渍法考察金属表面的除油效果[4]。将清洗后的工件浸在酸性硫酸铜水溶液(其组成为质量分数5％的CuS04和2％的H2S04)中，l min后取出工件，用水冲洗。根据铜膜情况评定清洁度，若铜膜完整均匀、光泽及结合力好，表明工件表面无油污；反之，工件表面有油污。 |
